Лабораторный контроль за течением вич-инфекции

Кристиан Хоффман, Кристиан Ноах Какие лабораторные показатели следует регулярно определять при ВИЧ-инфекции? Каких ре­зультатов следует ожидать? Этот раздел посвящен лабораторному контролю вирусной нагрузки и количества лимфоцитов CD4, регулярным осмотрам и определению сывороточной концент­рации препаратов. Тесты на резистентность вируса рассматриваются в другой главе (глава 10, «Определение резистентности ВИЧ»).

Первичному обследованию впервые обратившегося за помощью ВИЧ-инфицированного пациента также посвящена отдельная глава (см. главу 30 «Первичное обследование ВИЧ-инфицированного»). Вирусная нагрузка Вирусная нагрузка — это количество вирусных частиц в крови.

Наряду с количеством лимфо­цитов CD4, вирусная нагрузка является важнейшим косвенным показателем (суррогатным мар­кером) активности ВИЧ-инфекции (Hughes, 1997; Mellors, 1997; Lyles, 2000; Ghani, 2001; Phillips, 2004). Она позволяет оценивать риск прогрессирования болезни и определять показа­ния к началу антиретровирусной терапии. Кроме того, вирусная нагрузка служит важнейшим критерием эффективности лечения.

Раньше с этой целью использовали другие косвенные по­казатели — p24, неоптерин или бета2-микроглобулин. В настоящее время их не определяют, поскольку они не дают никакой дополнительной полезной информации. Методы определения вирусной нагрузки определяют концентрацию РНК ВИЧ (генетического материала ВИЧ), которая напрямую коррелирует с количеством вирионов.

Вирусная нагрузка измеряется числом копий РНК ВИЧ (геномных эквивалентов) в 1 миллилитре. Результат со­общают либо в виде количества копий/мл, либо в виде значения десятичного логарифма (lg). Изменение вирусной нагрузки на какую-либо величину десятичного логарифма означает, что она изменилась в количество раз, равное десяти в степени, равной этой величине.

Многие ла­боратории предоставляют результаты как в копиях/мл, так и в десятичных логарифмах копий/мл. Вирусная нагрузка ВИЧ не измеряется в стандартизованных международных еди­ницах в 1 мл, как вирусная нагрузка при гепатитах В или С. Вирусная нагрузка, копий/млLog10(lg)101,0501,71002,05002,710003,010 0004,050 0004,7100 0005,01 000 0006,0 ИнтерпретацияЧем больше вирусная нагрузка, тем выше риск снижения количества лимфоцитов CD4 и, сле­довательно, прогрессирования ВИЧ-инфекции и возникновения СПИД-индикаторных забо­леваний (Mellors, 1997; Lyles, 2000, Phillips, 2004). Высокой считается вирусная нагрузка, пре­вышающая 100 000 копий/мл или 5,0 lg (иногда даже выше 50 000 копий/мл), низкой — ниже 10 000 копий/мл (иногда меньше 5000 копий/мл). Однако это только ориентировочные значе­ния. Вирусная нагрузка может по-разному влиять на состояние иммунной системы: у одних паци­ентов количество лимфоцитов CD4 достаточно долго не меняется, несмотря на высокую ви­русную нагрузку, а у других оно быстро снижается даже при относительно невысокой вирусной нагрузке. Даже у так называемых «элитных контроллеров», у которых вирусная нагрузка оста­ется ниже порога определения в отсутствие АРТ, наблюдается медленное, но стабильное сни­жение количества лимфоцитов CD4 (Stellbrink, 2008). По-видимому, вирусная нагрузка у женщин в целом ниже, чем у мужчин. По данным метаана-лиза, различие между мужчинами и женщинами составило 41% или 0,23 lg (95% доверительный интервал 0,16—0,31 lg) (Napravnik, 2002). Причина такого различия пока не установлена. Кроме того, до сих пор специалисты не пришли к единому мнению о том, следует ли учитывать это различие при определении показаний к лечению.

Методы определения

На сегодняшний день применяются три метода определения вирусной нагрузки: полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), метод разветвленной ДНК (рДНК) и, реже, метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот (NASBA). У этих методов раз­ные пороги чувствительности и линейные диапазоны, в пределах которых результаты надежны и воспроизводимы (см. таблицу 6.11.1). В реакциях ОТ-ПЦР и NASBA вирусная РНК сначала проходит несколько этапов обработки ферментами, а затем амплифицируется до измеримого количества. Детектирование конечных продуктов осуществляется путем связывания меченых фрагментов ДНК. Метод разветвленной ДНК не требует предварительного расщепления ви­русной РНК ферментами; амплификация сигнала происходит путем связывания разветвленных фрагментов ДНК с вирусной РНК. Рынок лабораторных технологий не стоит на месте. Появляются новые тест-системы, посто­янно совершенствуются уже существующие. Например, компания Siemens предлагает прово­дить ОТ-ПЦР в дополнение к методу рДНК. Компания Roche сосредоточилась на усовершен­ствовании технологии ОТ-ПЦР, в том числе на разработке модификации «обнаружения двойной цели» (dual-target detection) для получения более точных результатов. Это означает, что теперь одновременно будут амплифицироваться два участка вирусной РНК, а не один, как раньше. Если один участок РНК не удастся амплифицировать по причине высокой вариабель­ности генома ВИЧ (результат в этом случае будет ложноотрицательный), то будет амплифици-рован второй участок. Помимо уже известных производителей лабораторного оборудования, рынок пытаются завоевать и пока неизвестные компании, например, Qiagen. Опыт покажет, насколько надежны тест-системы их производства. Вариабельность результатов в пределах каждого из трех методов невелика, поэтому в целом ожидаются воспроизводимые результаты, но при интерпретации результатов помнить о ней все-таки следует. Изменение вирусной нагрузки менее чем на 0,5 lg не считают значимым. К примеру, уменьшение вирусной нагрузки с 4,3 lg до 3,9 lg (то есть с 20 000 до 8 000 копий/мл) необязательно свидетельствует об истинном снижении вирусной нагрузки. То же самое спра­ведливо и для увеличения этого показателя. Таким образом, изменения вирусной нагрузки в 3 раза несущественны. Это очень важно объяснять пациентам. Вариабельность результатов, полученных тремя разными методами определения вирусной на­грузки, очень велика (Coste, 1996), поэтому пользоваться то одним методом, то другим не ре­комендуется. Обычно данные, полученные методом разветвленной ДНК, в 2 раза меньше, чем результаты ПЦР. Кроме того, методы отличаются чувствительностью к разным подтипам вируса (Parekh, 1999). Особого внимания требует обследование пациентов из Африки и Азии, где часто встречается ВИЧ не-В-подтипа — у них при первом обращении вирусная нагрузка часто ока­зывается неожиданно низкой. В таких случаях сменить метод определения вирусной нагрузки как раз необходимо. Новые диагностические наборы с усовершенствованными праймерами, вероятно, более чувствительны к редким подтипам ВИЧ. У всех методов есть линейный динамический диапазон, за пределами которого результаты не так точны. Важно следовать правилу: определять вирусную нагрузку всегда одним и тем же ме­тодом в одной и той же лаборатории. Лаборатория должна иметь опыт в проведении этих ис­следований и постоянно выполнять их в достаточном количестве. Анализ должен проводиться как можно скорее после забора крови; также важно соблюдать правила забора крови и транс­портировки центрифугированной плазмы в лабораторию (все это следует предварительно вы­яснить в самой лаборатории).

Таблица 6.11.1. Методы измерения вирусной нагрузки КомпанияТест-системаТехнологияПорог обнаружения (копий/мл)Линейный диапазон (копий/мл)Roche DiagnosticsCOBAS TaqMan HIV-1 Test; v2.0ОТ-ПЦР2020 - 10 000 000Siemens Healthcare DiagnosticsVersant HIV-1 RNA 1.0 Assay (кПЦР)ОТ-ПЦР3737 - 11 000 000Abbott MolecularAbbott RealTime HIV-1ОТ-ПЦР4040 - 10 000 000Siemens Healthcare DiagnosticsVersant HIV-1 RNA 3.0 Assay (рДНК)рДНК6550 - 500 000BiomerieuxNucliSENS EasyQ HIV v. 1.21NASBA25025 - 3 000 000 1 В мае 2009 ожидалось появление версии 2.0 с порогом обнаружения 35 копий/мл (линейный диапазон 15­3 000 000 копий/мл). кПЦР - кинетическая ПЦР или «ПЦР в реальном времени». Факторы, влияющие на величину вирусной нагрузкиНа величину вирусной нагрузки влияют не только особенности метода определения, но и мно­жество других факторов. В частности, она меняется после вакцинации и на фоне сопутствую­щих инфекций. Особенно высокой она бывает при острой оппортунистической инфекции. По данным одного исследования, при активном туберкулезе вирусная нагрузка повышается в 5— 160 раз (Goletti, 1996). Кроме того, она значительно повышается при сифилисе и уменьшается после успешного лечения (Buchacz, 2004; Kofoed, 2006; Palacios, 2007). В одном крупном рет­роспективном исследовании было обнаружено, что в 26% случаев транзиторная виремия у па­циентов, получающих АРТ, наблюдалась на фоне интеркуррентных инфекций (Easterbrook, 2002). В такое время определять вирусную нагрузку нет смысла. После вакцинаций, например, против гриппа (O'Brien, 1995) или пневмококка, (Farber, 1996) наблюдается преходящее повышение вирусной нагрузки (Kolber, 2002). Наиболее высокой она становится через 1—3 недели после вакцинации, поэтому контрольное исследование не­обходимо назначать не раньше, чем через 4 недели после введения вакцины. Необходимо от­метить, что повышение вирусной нагрузки не всегда свидетельствует о вирусологической не­эффективности лечения и резистентности вируса к препаратам. Кратковременные повышения вирусной нагрузки («всплески») обычно безвредны для пациента, что подтверждено результа­тами многочисленных исследований последних лет (см. раздел 4 «Цели и принципы лечения», глава 6). Кроме того, всегда следует допускать возможность перепутывания проб. При получе­нии неправдоподобно высоких или низких результатов необходимо обратиться в лабораторию за разъяснениями. Если лаборатория подтверждает эти результаты, необходимо повторить ана­лизы крови — людям свойственно ошибаться. При наличии сомнений в правильности кон­кретного результата можно попросить лабораторию повторить анализ с тем же образцом крови.