События после проникновения вируса в клетку

После слияния наружной оболочки вируса с клеточной мембраной вирусное ядро высвобож­дается в цитоплазму клетки-мишени. Недавно были получены новые сведения о том, как про­исходят эти «ранние события». ВИЧ способен проникать в лимфоциты макак-резусов, но до начала процесса обратной транскрипции или вскоре после него репликация вируса прекраща­ется. Эта внутриклеточная блокада опосредована клеточным фактором TRIM5a, который яв­ляется компонентом цитоплазматических телец, чья основная функция пока не установлена.

Молекулы TRIM5a, выделенные от животных разных видов, проявляют определенную специ­фичность в отношении взаимодействия с ретровирусами. Например, TRIM5a макак-резусов (TRIM5a rh) сильнее подавляет репликацию ВИЧ, чем TRIM5a человека, в то время как вирус иммунодефицита обезьян, который в естественных условиях патогенен для низших узконосых обезьян (Cercopithecidae), Менее чувствителен к любым формам TRIM5a, чем ВИЧ. Отчасти это объясняет видовую специфичность ВИЧ к клеткам человека (Stremlau 2004).

TRIM5a клеток человека и других приматов способен подавлять репликацию других лентивирусов и представ­ляет собой недавно открытый фактор клеточной защиты, биологическое значение которого до конца не ясно. Пока не установлено, как именно TRIM5a блокирует обратную транскрипцию; предполагается, что TRIM5a взаимодействует с капсидным белком проникающего в клетку ви­руса, присоединяя к нему «метки» из мономеров убиквитина для последующего направленного разрушения протеазами. Проникновение ВИЧ в покоящиеся Т-лимфоциты происходит таким же образом, как проник­новение в активированные T-лимфоциты, однако в покоящихся клетках не завершается синтезРис.

3.6. Жизненный цикл ВИЧ провирусной ДНК (Zack, 1990). Синтез провирусной ДНК на матрице вирусной РНК в цито­плазме клетки под действием фермента обратной транскриптазы — это ключевой момент про­цесса репликации ВИЧ (рис.

3.6). Блокирование обратной транскриптазы нуклеозидным ин­гибитором зидовудином было первой попыткой подавить размножение вируса у ВИЧ-1-инфицированных. Начиная с середины 80-х годов арсенал препаратов, относящихся к ингибиторам обратной транскриптазы, значительно пополнился, и сегодня в клинической практике применяются нуклеозидные, нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы. Обратная транскрипция происходит в несколько этапов. После связывания праймеров тРНК в участке PBS(primer binding site [участок связывания праймера]) начинается синтез минус-цепи провирусной ДНК, который завершается на 5'-концевом повторе с образованием короткой цепи ДНК R-U5. Следующий этап — расщепление РНК выше участка PBS вирусным фермен­том РНКазой H и сдвиг рамки ДНК R-U5 с гибридизацией в области R-участка на 3'-концевом участке РНК. После этого завершается синтез полноразмерной провирусной ДНК с последую­щим расщеплением тРНК. В результате обратной транскрипции образуется двойная цепь ДНК ВИЧ с длинными концевыми повторами (LTR) на каждом конце. В покоящихся T-лимфоцитах образованная в результате обратной транскрипции провирусная ДНК не встраивается в геном клетки хозяина. Для того чтобы клеточная ДНК встроилась в ДНК клетки-хозяина, необходима активация клетки и перемещение вирусного преинтегра-ционного комплекса из цитоплазмы в ядро. In vitro Активация клеток происходит, например, после стимуляции антигенами или митогенами, In vivo Активация иммунной системы наблю­дается после контакта с антигеном, вакцинации или на фоне оппортунистической инфекции. Кроме того, получены доказательства, что ВИЧ-1 способен самостоятельно активировать за­раженные клетки с помощью гликопротеина gp120. обеспечивая встраивание провирусной ДНК в клеточный геном.

Помимо моноцитов, макрофагов и клеток микроглии, латентно ин­фицированные покоящиеся лимфоциты CD4, в цитоплазме которых содержится не встроенная в клеточный геном провирусная ДНК ВИЧ, представляют собой клеточные резервуары ВИЧ, в которых вирус сохраняется длительное время (Chun, 1997), а клеточные микроРНК способ­ствуют сохранению вируса в латентном состоянии в покоящихся первичных лимфоцитах CD4 (Huang, 2007). Поскольку естественное течение ВИЧ-1-инфекции характеризуется постоянной репликацией вируса в активированных лимфоцитах CD4, пребывание вируса в латентном со­стоянии в покоящихся лимфоцитах CD4 скорее всего является случайным феноменом, не имеющим большого значения в патогенезе этой инфекции. Однако этот небольшой резервуар латентного провируса приобретает особое значение с началом ВААРТ: антивирусные препараты не действуют на нереплицирующиеся провирусы, поэтому ВИЧ, сохраняющий способность к размножению, продолжает персистировать в этих клетках и способен проявиться новым вспле­ском виремии при отмене препаратов.

Именно существование этого резервуара латентного ви­руса не позволяет добиться полного устранения (элиминации) вируса у ВИЧ-инфицированных с помощью ВААРТ (Chun, 2005). Лишь недавно стало ясно, почему ВИЧ плохо реплицируется в покоящихся лимфоцитах CD4. Клеточный белок Murr1, участвующий в метаболизме меди, способен подавлять репликацию ВИЧ-1 в нестимулированных лимфоцитах CD4.

Белок Murr1 был обнаружен в первичных по­коящихся лимфоцитах CD4, в которых он подавляет активацию фактора транскрипции NF-kB, блокируя деградацию ингибиторного белка LcBa. LcBa препятствует перемещению NF-kB в ядро, особенно после цитокиновой стимуляции (например, воздействия ФНОa). По­скольку область LTR ВИЧ содержат множество участков связывания NF-kB, предотвращение миграции NF-kB в ядро должно подавлять репликацию ВИЧ.

Ингибирование Murr-1 с помо­щью миРНК приводит к репликации ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4 (Ganesh, 2003). Пер-систирование ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4 и других клетках-резервуарах считается ос­новной причиной невозможности полной элиминации вируса. Если это в принципе достижимо, получение подробных сведений о том, как и когда появляются клеточные резер­вуары ВИЧ и как на них можно воздействовать, имеет первостепенное значение для разработки направлений лечения, нацеленных на полное устранение инфекции.

Клеточные факторы транскрипции, в частности NF-kB, также могут связываться с областью LTR ВИЧ. После стимуляции митогенами или цитокинами фактор NF-kB транслоцируется в ядро, где связывается с областью LTR ВИЧ, запуская транскрипцию вирусных генов. В резуль­тате транскрипции сначала синтезируются регуляторные вирусные белки, в частности Tat и Rev.

В ядре клетки белок Tat связывается с трансактивируемым регуляторным элементом (transacti-vation-response element, TAR), расположенным в начале вирусной РНК, и стимулирует транс­крипцию и образование длинных транскриптов РНК. Белок Rev стимулирует экспрессию генов, отвечающих за синтез структурных белков и ферментов, и подавляет продукцию регу-ляторных белков, тем самым обеспечивая образование зрелых вирусных частиц. Белки, коди­руемые генами Pol И Gag, Образуют вирусный капсид; продукты гена Env Образуют поверхностный гликопротеин gp120 — «шипы» внешней оболочки вируса.

Гликопротеин gp120 образуется в ре­зультате расщепления вирусной протеазой своего предшественника — гликопротеина gp160 — на gp120 и gp41. Продукты гена Gag Также образуются в результате расщепления протеазой ВИЧ белка-предшественника массой 53 кДа на белки p24, p17, p9 и p7. Поскольку расщепление мо­лекул—предшественников протеазой ВИЧ — необходимое условие для образования новых пол­ноценных вирусных частиц, этот фермент служит еще одной мишенью для антиретровирусной терапии.

Сборка вирусов происходит поэтапно: из вирусной РНК, белков Gag и ферментов Pol образуется нуклеокапсид, который перемещается к клеточной мембране. Крупные молекулы-предшественники расщепляются вирусной протеазой, после чего завершается сборка зрелых вирусов и они отпочковываются от клетки. При отпочковывании в липидную оболочку вируса могут встраиваться различные белки клетки-хозяина, некоторые фосфолипиды и молекулы хо­лестерина.

В отличие от T-лимфоцитов, в которых отпочковывание происходит на поверхности клеток и приводит к выделению вирусов в межклеточное пространство, в моноцитах и макро­фагах процесс завершается накоплением вируса внутри клеточных вакуолей. Репликация ретровирусов происходит с ошибками и характеризуется высокой частотой спон­танных мутаций. В среднем при обратной транскрипции происходит от 1 до 10 ошибок на один геном или на один цикл репликации.

Мутации могут приводить к образованию вирионов со сниженной способностью к репликации. С другой стороны, могут появляться и накапливаться мутации, в результате которых вирус приобретает устойчивость к антивирусным препаратам. На фоне селективного воздействия антиретровирусных препаратов при условии неполного по­давления репликации вируса в организме ВИЧ-инфицированного начинают преобладать ви­русы, резистентные к препаратам.

Кроме того, для ВИЧ характерна высокая скорость репликации и большой «оборот» вирусных частиц: в среднем за сутки образуется и погибает 1 миллиард вирусных частиц. Вследствие вы­сокой скорости размножения вируса и большой частоты мутаций в организме ВИЧ-инфици­рованного накапливается множество близких вариантов вируса, так называемых «псевдовидов» или «квазивидов» (quasispecies). Преимущество в выживании получают псевдовиды, приобрет­шие в результате мутаций устойчивость не только к антиретровирусным препаратам, но и к фак­торам иммунной защиты, таким как нейтрализующие антитела и цитотоксические T-лимфо-циты (ЦТЛ).