Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции крайне важна для своевременного обеспечения пациента антиретровирусными препаратами. Несмотря на обширные возможности тестирования на ВИЧ и множество рекомендаций по его проведению, ВИЧ-инфекция продолжает выявляться чаще на поздних стадиях. Почти у каждого третьего пациента на момент установления диагноза ВИЧ-инфекции уже есть выраженный иммунодефицит со снижением количества лимфоцитов CD4 до уровня
Быстрая диагностика также важна для предупреждения дальнейшего распространения инфекции. По новым германским стандартам оказания дородовой помощи всем беременным следует предлагать пройти тестирование на ВИЧ. Тестирование на ВИЧ также играет важную роль в обеспечении безопасности переливаемой крови и донорских органов.
Основные сведения о диагностике ВИЧ-инфекции
Фундаментом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции служат скрининговые тесты на ВИЧ. Реактивный результат скринингового теста должен быть обязательно подтвержден другим методом (подтверждающий тест). Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции следует пользоваться тест-системой 4-го поколения («Combo test»), которая одновременно выявляет как антитела к ВИЧ, так и антиген p24, и обладает относительно высокой чувствительностью (Breast, 2000; Weber, 2002; Sickinger, 2004; Skidmore, 2009). «Серонегативные» случаи ВИЧ-инфекции встречаются крайне редко и в практической работе ими можно пренебречь (Connick, 2005; Kas-sutto, 2005). Все одобренные к применению скрининговые тест-системы выявляют ВИЧ всех известных типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), групп и подтипов. В продаже есть множество тест-систем для скрининговой диагностики ВИЧ-инфекции, однако в их основе лежит один и тот же принцип — образование комплексов антиген-антитело. Прототипом всех тест-систем послужила технология ELISA (технология твердофазного иммуно-ферментного анализа). Ее основной элемент — пластиковая плашка с 96 лунками (микротит-ровальная плашка). На поверхность каждой лунки нанесены антигены ВИЧ и антитела к ВИЧ. Когда сыворотка или плазма крови пациента, в которой содержатся антитела к ВИЧ, попадает в лунку, антитела связываются с нанесенными на поверхность лунки антигенами ВИЧ. Затем в лунку добавляют меченные ферментом антитела, распознающие человеческие антитела и связывающиеся с ними. Наконец, добавляется субстрат для фермента, которым помечены антитела к человеческим антителам. В результате взаимодействия фермента с субстратом раствор меняет цвет. Степень изменения цвета определяют фотометрическим методом. Оптическая плотность коррелирует с концентрацией антител к ВИЧ — чем выше интенсивность окраски, тем больше антител содержится в образце сыворотки (плазмы) крови пациента. В этот прототип было внесено несколько улучшений, которые позволили повысить результативность и эффективность скрининговых тест-систем (Perry, 2008). Процесс работы с современными тест-системами практически полностью автоматизирован, что обеспечивает высокую степень стандартизации и позволяет получить результат менее чем за час. В этих системах твердая фаза представляет собой микрочастицы с нанесенными антигенами вируса и антителами к вирусу. Поэтому метод получил название «иммуноферментный анализ на микрочастицах» (ИФАМ). Получаемый результат обычно представляет собой величину, не имеющую единицы измерения, вычисляемую как отношение оптической плотности образца биологического материала пациента к оптической плотности отрицательного контроля (Образец/Контроль). Если отношение меньше 1, то результат исследования интерпретируют как «отрицательный», если же оно больше 1, то результат интерпретируют как «реактивный». Такой результат скринингового теста следует называть «реактивным», а не «положительным», поскольку его необходимо подтверждать с по- мощью второго анализа другим методом. В случае проведения скрининговых тестов предпочтительно использовать тест-системы с максимальной чувствительностью (чтобы не пропустить ни одного случая инфицирования), в то время как для подтверждающего теста в первую очередь важна высокая специфичность. Одобренные к применению в Германии скрининговые тест-системы обладают специфичностью в 99,5%. Это значит, что при исследовании 200 ВИЧ-отрицательных образцов в одном случае может быть получен ложнореактивный результат. Ложноположительные результаты в том числе могут наблюдаться при состояниях, стимулирующих иммунную систему (например, при вирусных инфекциях, на фоне беременности, после вакцинации, при аутоиммунных заболеваниях). Поэтому у пациентов из определенных групп (беременных или получающих диализ) выше вероятность получения ложнореактивного результата теста на ВИЧ. Для подтверждения реактивного результата скринингового теста обычно применяется метод иммуноблоттинга (Вестерн блот ). Вирусные белки (антигены) разделяются по молекулярному весу электрофорезом и переносятся на мембрану, которая затем используется в качестве тест-полоски. Тест-полоска инкубируется с сывороткой или плазмой крови пациента. При наличии в ней антител к ВИЧ они связываются с антигенами. Аналогично методу ИФА (ELISA) (см. выше) образовавшиеся комплексы антиген-антитело проявляются на тест-полоске с помощью меченных ферментом антител к человеческим антителам и добавления соответствующего субстрата для ферментативной реакции.
В соответствии со специфичностью содержащихся в образце антител на тест-полоске появляются определенные сочетания полос. Белки ВИЧ подразделяются на три функциональные группы («р» — белок, «gp» — гликопро-теин; числа соответствуют молекулярному весу): белки оболочки (env): gp41, gp160, gp120 белки полимеразы (pol): р31/р34, р39/р40, р51/р52, р66/р68 белки ядра (gag): р17/р18, р24/р25, р55 Образование антител после инфицирования подчиняется определенным закономерностям: антитела к p24 и gp120 определяются рано, в то время как полоска, соответствующая наличию антител к р31, появляется позже (Fiebig, 2003). Результат Вестерн блота расценивается как положительный при обнаружении не менее двух или трех полос. Единые международные критерии положительного результата по специфичности антител отсутствуют.
Согласно германским рекомендациям, основывающимся на нормативе 58969 часть 41 Немецкого нормативного института (DIN 58 969 Part 41) («серодиагностика инфекционных болезней методом иммуноблот-тинга»), результат анализа следует интерпретировать как положительный, если выявлены антитела к белку env, а также антитела к белку Gag И/или к белку pol. По критериям ВОЗ результат Вестерн-блота положителен, если выявлены антитела по крайней мере к двум белкам Env. «Американский красный крест» определяет положительный результат как наличие антител к не менее чем одному белку из каждой группы (gag, Pol И env). Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) рекомендует расценивать результат как положительный только при наличии полос, соответствующих белкам р24, р34 и gp41 или gp120/160.
Например, при обнаружении двух полос, соответствующих gp120 и р24, по критериям ВОЗ результат следует интерпретировать как сомнительный, а по германским критериям как положительный. Слабое окрашивание полос может указывать на раннюю фазу ВИЧ-инфекции; в этом случае необходимо уточнить диагноз другими методами, например, с помощью ПЦР (см. ниже).
По сравнению с тест-системами 4-го поколения определение антигена р24 не входит в подтверждающий анализ. В случае получения реактивного результата скринингового теста и отрицательного результата подтверждающего теста нельзя исключить острую ВИЧ-инфекцию, при которой ВИЧ-специфические антитела еще не достигли диагностического титра, а антиген р24 уже определяется в крови. В такой ситуации следует повторить тестирование на ВИЧ через 2— 3 недели.
При подозрении на острую ВИЧ-инфекцию (острый ретровирусный синдром, недавний опасный контакт с биологическими жидкостями ВИЧ-инфицированного) полезно сделать ПЦР на ВИЧ. ПЦР также рекомендуется выполнять в случаях высокоположительного резуль- тата скринингового теста и отрицательного результата подтверждающего теста. Рекомендуется проконсультироваться с работниками лаборатории для получения информации о порядке проведения исследований.
В идеале лаборатория должна выполнять Вестерн блот, в котором также предусмотрена возможность выявления антител к ВИЧ-2. Как правило, для этой цели используется синтетический белок ВИЧ-2. В случае обнаружения реактивной полосы, соответствующей белку ВИЧ-2, результат следует подтвердить с помощью ВИЧ-2-специфического Вестерн блота.
В качестве альтернативы Вестерн блоту для подтверждения реактивного результата скринин-гового теста может применяться менее распространенный метод иммунофлюоресценции. Для того чтобы исключить возможность использования по ошибке чужого образца, второй тест для подтверждения положительного результата скринингового теста проводят только с новым образцом крови. Если у пациента предполагается наличие ВИЧ-инфекции, подтвердить диагноз можно результатом измерения вирусной нагрузки (см.
раздел 11 «Лабораторный контроль за течением ВИЧ-инфекции», глава 6). В этом случае в серологическом тесте нет необходимости. Помимо серологических тест-систем применяются методы выявления вирусной РНК, такие, как ПЦР на ВИЧ.
Количественное определение РНК ВИЧ (определение вирусной нагрузки) — одна из основных составляющих наблюдения за течением ВИЧ-инфекции (Berger, 2002; Wit-tek, 2007). Однако при установлении первичного диагноза ВИЧ-инфекции применение ПЦР на ВИЧ ограничено только определенными клиническими ситуациями, например, эта методика может применяться при подозрении на острую инфекцию или вертикальную передачу ВИЧ (см. ниже).
В общем случае для исключения ВИЧ-инфекции метод ПЦР лишь условно пригоден и не может заменить серологический тест на ВИЧ. Кроме того, имеющиеся в продаже тест-системы еще не валидированы производителями для первичной диагностики ВИЧ-инфекции.
Оставить отзыв
Для отправки комментария вам необходимо авторизоваться.