Токсическое действие ниот на митохондрии

Ульрих А. Уокер и Нильс ВенхоффВведение Через два года после появления в арсенале антиретровирусной терапии ингибиторов протеазы стали появляться сообщения о заметных нарушениях метаболизма и изменении внешности у ВИЧ-инфицированных. Эти «метаболические» симптомы первоначально объединили под общим термином «липодистрофия» (Carr, 1998). Согласно современной точке зрения, липоди-строфический синдром развивается в результате частично перекрывающихся, но отдельных по­бочных эффектов разных препаратов, входящих в схемы АРТ.

Главный механизм в патогенезе вызываемых НИОТ метаболических нарушений и повреждений различных органов — это ток­сическое действие на митохондрии (Brinkman, 1999). Патогенез токсического действия НИОТ на митохондрии Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) представляют собой проле-карства, т. е.

неактивную форму препарата (Kakuda, 2000). Ингибировать активность фермента-мишени — обратной транскриптазы ВИЧ — они способны только после перехода в активную форму путем внутриклеточного фосфорилирования. НИОТ-трифосфаты не только нарушают процесс репликации ВИЧ, но также подавляют полимеразу человека, так называемую «гамма— полимеразу», необходимую для репликации митохондриальной ДНК (мтДНК).

Угнетение этими препаратами гамма-полимеразы приводит к снижению концентрации мтДНК — неболь­шой кольцевой молекулы, множество копий которой в норме содержится в каждой митохонд­рии, а в большинстве клеток человеческого организма их сотни. Поэтому подавление гамма-полимеразы препаратами группы НИОТ приводит к уменьшению концентрации (истощению) мтДНК (Lewis 2003). Биологическая роль мтДНК состоит в том, что она кодирует субъединицы ферментов дыхательной цепи, которые располагаются на внутренней мембране митохондрий.

Таким образом, снижая концентрацию мтДНК, НИОТ приводят к нарушению функции дыха­тельной цепи. Нормальное функционирование дыхательной цепи — обязательное условие протекания многих метаболических процессов. Главная задача дыхательной цепи — синтез АТФ (главного «энер­гоносителя» клетки) путем окислительного фосфорилирования.

Кроме того, дыхательная цепь обеспечивает утилизацию НАДН (восстановленного никотинамидадениндинуклеотида) и ФАДН (восстановленного флавинадениндинуклеотида) — конечных продуктов окисления жир­ных кислот. Этим объясняется мелко - и крупнокапельное внутриклеточное отложение тригли-церидов, которое часто обнаруживается на фоне токсического действия НИОТ на митохондрии. Наконец, что немаловажно, нормальное функционирование дыхательной цепи необходимо для синтеза ДНК, поскольку синтез пиримидиновых нуклеозидов De novo Происходит при уча­стии фермента, расположенного на внутренней мембране митохондрий — дигидрооротатде-гидрогеназы (ДГОДГ) (L^fler, 1997).

Клиническое значение этого факта будет рассмотрено дальше. В развитии токсического повреждения митохондрий можно выделить несколько закономер­ностей (Walker, 2002a): 1. Токсическое повреждение митохондрий зависит от концентрации НИОТ.

Высокие концент­рации НИОТ вызывают более выраженное снижение концентрации мтДНК, чем низкие. Те­рапевтические дозы некоторых НИОТ близки к порогу токсичности для митохондрий. 2.

Токсическое повреждение митохондрий развивается медленно. Изменения метаболизма ми­тохондрий наблюдаются только после уменьшения концентрации мтДНК ниже определен­ной пороговой величины, что возможно только при длительном лечении НИОТ. В связи с этим в первые месяцы приема АРТ симптомы повреждения митохондрий обычно не по­являются.

Кроме того, длительное лечение НИОТ может привести к повреждению митохонд­рий даже при относительно низких концентрациях НИОТ. 3. У разных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов способность взаимодействовать с гамма-по-лимеразой существенно различается. В порядке убывания ингибирующего действия на гамма-полимеразу активные метаболиты НИОТ располагаются следующим образом: заль-цитабин (ddC, Хивид®) > диданозин (ddI, Видекс®) > ставудин (d4T, Зерит®) > ламивудин (3TC, Эпивир®) > абакавир (ABC, Зиаген®) > тенофовир (TDF, Вирид®) > эмтрицитабин (FTC, Эмтрива®). 4. Особенность зидовудина (AZT, Ретровир®) в том, что его активная форма — трифосфат — очень слабый ингибитор гамма-полимеразы. Однако зидовудин способен снижать концент­рацию мтДНК иным способом. Зидовудин ингибирует митохондриальный фермент тими-динкиназу 2-го типа (ТК-2) и тем самым нарушает синтез пиримидиновых нуклеотидов, что, в свою очередь, угнетает синтез мтДНК (McKee, 2004). Известно, что при врожденной недо­статочности фермента ТК-2 наблюдается уменьшение концентрации мтДНК в мышечной ткани человека (Saada, 2001). Кроме того, было обнаружено, что зидовудин без участия фер­ментов может превращаться в ставудин, по крайней мере в некоторых клетках (Becher, 2003; Bonora, 2004). 5. Митохондриальная токсичность тканеспецифична. Это объясняется тем, что захват неактив­ной формы НИОТ клетками и их митохондриями, а также фосфорилирование с переходом препарата в активную форму в разных типах клеток различается. 6. При комбинировании двух и более НИОТ в их токсическом действии на митохондрии воз­можен кумулятивный эффект и синергизм. 7. Получены некоторые данные, свидетельствующие о том, что НИОТ могут нарушать процесс транскрипции в митохондриях без повреждения мтДНК (Galluzzi, 2005; Mallon, 2005). Од­нако механизм этого явления и его клиническое значение еще не установлены.

Клинические проявления

Снижение уровня мтДНК клинически может проявляться поражением одного или нескольких органов-мишеней (см. рис. 9.1). В клетках Печени Токсическое повреждение митохондрий сопровождается повышенным накоп­лением липидов, что приводит к мелко - или крупнокапельной жировой дистрофии печени. Иногда этому сопутствует повышение активности трансаминаз. В этом случае жировая дистро­фия печени может прогрессировать с развитием печеночной недостаточности и лактацидоза — угрожающего жизни, но, к счастью, редкого осложнения.ЦНС? Липоатрофия Гиперхолестеринемия? Инсулинорезистентность? Гиперурикемия? Кардиомиопатия Гепатотоксичность Панкреатит? Синдром Фанкони Перинатальная токсичность? Лимфопения Анемия Мышечная слабость Миалгия Гиперлактатемия Полинейропатия Рис. 9.1. Клинические проявления токсического повреждения митохондрий со стороны разных и систем.Впервые жировая дистрофия печени и лактацидоз были описаны в начале 90-х гг. у больных, получавших монотерапию диданозином (Lambert, 1990); сейчас симптомы токсического по­вреждения митохондрий клеток печени наблюдаются при лечении любыми НИОТ, оказываю­щими относительно мощное ингибирующее действие на гамма-полимеразу — особенно так на­зываемыми «d-препаратами»: диданозином (ddl), ставудином (d4T) (и, в прошлом, зальцитабином [ddC]). Тем не менее, побочные эффекты со стороны печени также были опи­саны при приеме зидовудина. Показано, что каждый из d-препаратов у ВИЧ-инфицированных приводит к зависимому от времени снижению уровня мтДНК в гепатоцитах. При электронной микроскопии обнаруживаются морфологические изменения митохондрий.

Типичное осложнение токсического повреждения митохондрий — Повышение сывороточного уровня лактата. Гиперлактатемия чаще описывалась у пациентов, длительно принимавших ста­вудин (Saint Marc, 1999; Carr, 2000), особенно в комбинации с диданозином. Токсичность ди-данозина также повышается в результате лекарственных взаимодействий с рибавирином и гид-роксимочевиной. Клиническое значение бессимптомной гиперлактатемии не установлено.

Если повышение уровней лактата проявляется клинически, симптомы часто бывают неспеци­фичными — тошнота, болезненность в правом подреберье, миалгии. В большинстве случаев уровень бикарбоната и анионный интервал (Na+ [HCO3 + Cl]) остаются в пределах нормы, хотя активность печеночных трансаминаз в большинстве случаев слегка повышена (Lonergan, 2000). Поэтому для установления диагноза приходится выполнять более трудоемкий анализ — опре­деление сывороточного уровня лактата.

Чтобы избежать ошибок, забор венозной крови следует выполнять без наложения жгута у отдохнувшего пациента. Кровь необходимо собрать во фто­рированные пробирки, поместить на лед и сразу доставить в лабораторию для незамедлитель­ного исследования. В дифференциальной диагностике следует учитывать, что причиной лак-тацидоза может быть не только повреждение митохондрий (см.

таблицу 9.1); необходимо также исключить повреждение различных органов. Митохондриальная миопатия У ВИЧ-инфицированных, получающих антиретровирусные пре­параты, впервые была описана при лечении высокими дозами зидовудина (Arnaudo, 1991). Сла­бость скелетных мышц может проявляться при динамической или статической нагрузке.

Сы­вороточный уровень КФК часто бывает в норме или немного повышен. Гистологическое исследование биоптатов мышц позволяет отличить токсическое действие НИОТ на митохонд­рии от ВИЧ-миопатии, которая может развиться одновременно. При митохондриальной мио-патии при гистохимическом исследовании мышечных волокон нередко отсутствует фермент цитохром-c-оксидаза и выявляются ультраструктурные изменения митохондрий, а при ВИЧ-миопатии обычно обнаруживается инфильтрация мышечных волокон Т-лимфоцитами CD8.

Исследование при нагрузке позволяет обнаружить низкий лактатный порог и снижение клиренса лактата, однако в клинической практике эти изменения трудно отличить от плохой переносимости аэробной нагрузки (нетренированности). Таблица 9.1. Причины гиперлактатемии и лактацидоза Лактацидоз типа AЛактацидоз типа B(Тканевая гипоксия) Шок Отравление окисью углерода Сердечная недостаточность(Другие механизмы) Дефицит тиамина Алкалоз (pH>7,6) Эпилепсия Адреналин (ятрогенный, эндогенный) Печеночная недостаточность Злокачественные новообразования (лимфома, солидные опухоли) Интоксикации (нитропруссид, метанол, этиленгликоль, салицилаты) Фруктоза Редкие ферментопатии Мутации мтДНК Снижение уровня мтДНК Длительное лечение d-препаратами также нередко приводит к преимущественно симметрич­ной, сенсорной и дистальной Полинейропатии Нижних конечностей (Simpson, 1995; Moyle, 1998). Повышенный уровень сывороточного лактата помогает отличить эту форму аксональной нейропатии от ВИЧ-ассоциированной полинейропатии с такими же клиническими проявле­ниями, но, в большинстве случаев, без повышения уровня лактата.

Проводя дифференциаль- ную диагностику, следует также принимать во внимание тот факт, что токсическое повреждение митохондрий развивается в большинстве случаев через несколько недель и месяцев после на­чала лечения d-препаратами. Напротив, ВИЧ-ассоциированная полинейропатия обычно не прогрессирует, а порой даже ослабевает на фоне длительной антиретровирусной терапии. У мышей зидовудин и зальцитабин вызывают токсическое повреждение митохондрий нейронов, при этом зальцитабин преимущественно поражает периферическую, а зидовудин — централь­ную нервную систему.

Это соответствует нарушениям, наблюдающимся у получающих эти пре­параты пациентов (Moyle, 1998; Tardieu, 2005); при этом токсическое действие зидовудина на ЦНС вполне правдоподобно, поскольку зидовудин хорошо проникает через геметоэнцефали-ческий барьер. В более узком смысле термин «липодистрофия» применяется для описания перераспределения жировой ткани. У некоторых пациентов липодистрофия проявляется избыточным накопле­нием жира в определенных местах (чаще всего в области живота и на задней поверхности шеи), а у других — напротив, уменьшением жировой ткани (исчезновение жировых комочков Биша на щеках, подкожного жира в височной области и на конечностях).

В некоторых случаях избы­точное отложение жира в одних местах сочетается с уменьшением жировой ткани в других. Уменьшение жировой ткани (липоатрофия) Частично обратимо и обычно становится заметным не раньше чем через год после начала антиретровирусной терапии. В пораженной подкожной жировой клетчатке выявляются ультраструктурные изменения митохондрий и сниженное со­держание мтДНК, в особенности у пациентов, получавших ставудин (Walker, 2002b).

При ис­следованиях жировых клеток In vitro И In vivo Было обнаружено сниженное внутриклеточное со­держание липидов, уменьшение экспрессии факторов адипогенной транскрипции (PPAR-гамма и SREBP-1) и повышение индексов апоптоза. НИОТ могут также нарушать не­которые эндокринные функции липоцитов. Например, они снижают секрецию адипонектина и тем самым способствуют развитию инсулинорезистентности.

В наибольшей степени это по­бочное действие выражено у ставудина, хотя и другие НИОТ, например, зидовудин, тоже могут оказывать подобный эффект. Если ставудин заменить другим НИОТ, уровни мтДНК и индексы апоптоза улучшаются (McComsey, 2005), а также отмечается поддающееся измерению, хотя и небольшое, увеличение объема подкожной жировой клетчатки (McComsey, 2004). Замена ин­гибиторов протеазы не приводит к уменьшению липоатрофии и апоптоза адипоцитов.

Все эти факты указывают на доминирующий эффект токсического поражения митохондрий в патоге­незе липоатрофии. В нескольких исследованиях было показано влияние НИОТ на уровни мтДНК в крови (Cott, 2003; Miro, 2003). Функциональные последствия токсического повреждения митохондрий для Лимфоцитов Пока не известны.

В данном случае важно заметить, что при повышении уровней диданозина в плазме крови (при одновременном приеме с тенофовиром или у пациентов с низ­ким весом) наблюдалось отсроченное снижение числа лимфоцитов CD4 и CD8 (Negredo, 2004). Недавние исследования стимулированных митогенами T-лимфоцитов In vitro Показали, что ди-данозин в концентрации, немного превышающей терапевтическую, вызывал значительное сни­жение уровня мтДНК и последующее отсроченное снижение пролиферации лимфоцитов и уси­ление апоптоза (Setzer, 2005a; Setzer, 2005b). Таким образом, токсическое повреждение митохондрий — наиболее вероятное объяснение позднего снижения количества лимфоцитов при лечении диданозином.

Данные показывают, что токсическое повреждение митохондрий, обусловленное НИОТ, оказывает иммуносупрессорное действие на лимфоциты. В редких случаях на фоне АРТ наблюдается бессимптомное повышение активности Сывороточ­ной липазы, Однако прогностического значения в отношении возникновения панкреатита оно не имеет (Maxson, 1992). В целом частота панкреатита оценивается в 0,8 случаев на 100 лет приема НИОТ-содержащих схем АРТ.

Клинически выраженный панкреатит чаще развивается при лечении диданозином. Возобновление приема диданозина после перерыва может спрово­цировать рецидив панкреатита, поэтому крайне нежелательно. Высказывалось предположение, что причиной панкреатита может быть токсическое повреждение митохондрий, но пока оно не доказано.

Кроме того, у пациентов, получавших дидезоксинуклеозиды (диданозин и ставудин), наблю­далось повышение концентрации уратов в сыворотке крови. Нарушение образования АТФ в результате токсического повреждения митохондрий может приводить к повышению продукции мочевой кислоты в цикле пуриновых нуклеозидов (Walker, 2006b). В настоящее время результаты нескольких исследований положили конец долгим спорам, пре­доставив доказательства, что TDF действительно вызывает токсическое повреждение мито­хондрий в ткани почек.

TDF (тенофовир) — нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы (Вирид®). Сообщалось о случаях нарушения функции почек, синдрома Фанкони и остеомаля­ции у животных (Tenofovir review team, 2001) и пациентов (Gupta, 2008; Wanner, 2009), получав­ших тенофовир. У пациентов, получающих TDF, часто обнаруживаются повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови и гипофосфатемия вследствие уменьшения реабсорб-ции фосфатов в почках (Kinai, 2005).

Кроме того, у пациентов, получавших тенофовир, наблю­далась остеомаляция, особенно при приеме тенофовира в комбинации с LPV/r (Parsonage, 2005; Wanner, 2009). TDF реабсорбируется в проксимальных почечных канальцах с помощью чело­веческих транспортных белков 1-го и 3-го типов для переноса органических анионов (hOAT-1 и hOAT-3). Несмотря на то, что TDF является слабым ингибитором гамма-полимеразы, белки-переносчики hOAT-1 и hOAT-3 способны создать достаточно высокую концентрацию тенофо-вира в клетках эпителия почечных канальцев, чтобы произошло значимое угнетение синтеза мтДНК (Cote, 2006).

Сниженные уровни мтДНК обнаруживались в почечных биоптатах паци­ентов, получавших TDF+ddI — комбинацию НИОТ, которая больше не рекомендуется к при­менению (Cote, 2006). У крыс тенофовир вызывал органоспецифическое токсическое пораже­ние почек со снижением концентрации мтДНК и нарушением функции кодируемых мтДНК субъединиц ферментов дыхательной цепи (Lebrecht, 2009). В связи с вышеизложенным не ре­комендуется назначать тенофовир пациентам с нарушениями функции почек.

При применении зидовудина для профилактики вертикальной передачи ВИЧ наблюдается сни­жение концентраций мтДНК в плаценте, а также в пуповинной крови новорожденных, чьи ма­тери получали зидовудин в перинатальном периоде (Divi, 2004, Shiramizu, 2003; Gingelmaier, 2009). У детенышей, родившихся от обезьян, получавших комбинацию зидовудина с ламиву-дином до родов, зидовудин был обнаружен в составе мтДНК. Кроме того, было обнаружено снижение уровня мтДНК в скелетных мышцах, сердце и головном мозге новорожденных обезьян (Gerschenson, 2004); в некоторых животных моделях перинатально возникшие нару­шения сохранялись в течение нескольких месяцев после отмены НИОТ.

Обнаружена повышенная частота митохондриальных симптомов и патологических изменений ткани головного мозга, обнаруживаемых с помощью визуальных методов исследования у детей, рожденных женщинами, получавшими НИОТ во время беременности (Blanche, 1999; Tardieu, 2005). Нередко у новорожденных обнаруживается гиперлактатемия; иногда она сохраняется в течение нескольких месяцев после рождения (Noguera, 2003). Другие клинические исследова­ния не выявили повышенного риска при перинатальной профилактике зидовудином, однако ключевые показатели токсического поражения митохондрий в них не оценивались.

Необхо­димо срочно провести анализ отдаленных данных (Venhoff, 2006). Тем не менее, полученной на сегодняшний день информации недостаточно, чтобы отказаться от действующих рекомендаций по применению зидовудина для профилактики вертикальной передачи ВИЧ в составе комби­нированной схемы АРТ для матери.

Наблюдение

На сегодняшний день не существует надежных методов оценки индивидуального риска токси­ческого повреждения митохондрий. Регулярное определение уровня лактата всем получающим НИОТ пациентам в отсутствие симптомов не обосновано, поскольку повышенный уровень лактата в отсутствие симптомов не служит прогностическим фактором клинически значимого токсического повреждения митохондрий (McComsey, 2004 г). Определение уровня мтДНК в мононуклеарах периферической крови ненадежно. По-видимому, более чувствительным мето­дом является определение уровня мтДНК в пораженных тканях, однако этот метод подразуме­вает проведение инвазивного вмешательства, и он не оценивался в проспективных исследова­ниях с точки зрения клинических исходов. При установившейся симптоматике в диагностике помогает гистологическое исследование биоптатов. В пользу токсического повреждения митохондрий свидетельствуют: ультраструк­турные изменения митохондрий, сниженная гистохимическая активность цитохром-c-окси-дазы, внутриклеточная (особенно мелкокапельная) жировая дистрофия печени и так называе­мые «рваные красные мышечные волокна».