Какова роль культурального метода исследования в диагностике и выявлении случаев заболевания туберкулезом?

Роль посевов для выявления микобактерий в диагностике туберкулеза

Возможность обнаружения кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) при бак-териоскопическом исследовании зависит от концентрации возбудителей в мо­кроте (см. главу 4 «Сколько туберкулезных микобактерий содержится в образ­це мокроты при положительных результатах микроскопии ее мазков?» и главу 5 «Насколько достоверны результаты бактериоскопического исследования маз­ков мокроты?»). При концентрации бактерий ниже 1 000 в 1 мл вероятность их обнаружения в мазках становится ниже 10%. В сравнении с этим посев позво­ляет обнаружить гораздо меньшее число КУМ, вплоть до 100 микроорганизмов в 1 мл мокроты. Кроме того, посевы позволяют идентифицировать вид мико-бактерий на основании их биохимических и иных свойств. Микроскопия маз­ков не позволяет дифференцировать патогенные микобактерии от непатоген­ных, которые также обладают кислотоустойчивостью и имеют сходную морфо­логию. Поэтому может создаться впечатление, что диагностика туберкулеза на основании метода посева намного чувствительнее и специфичнее, чем с помо­щью метода микроскопии мазков.

Однако на практике диагностическая эффективность любого метода опре­деляется его завимостью от технических сложностей и конкретной обстановки, в которой он выполняется. В случае микроскопии для выявления КУМ техни­ческие погрешности почти никогда не снижают весьма высокую его специфич­ность (см. главу 5 «Насколько достоверны результаты бактериоскопического исследования мазков мокроты?»). Из-за своей высокой чувствительности посе­вы для выявления микобактерии туберкулеза более склонны к снижению спе­цифичности при контаминации. Так, в результате различных манипуляций бактерии могут быть перенесены из содержащих их образцов в образцы мокро­ты, не содержащие их. Значимость этой проблемы была изучена сотрудничаю­щими лабораториями Восточной Африки Британского совета по медицинским исследованиям. Образцы мокроты, содержащие микобактерии туберкулеза, устойчивые лишь к одному рифампицину, смешивали с мокротой, не содержа­щей микобактерий. В последующем этот штамм возбудителя мог быть просле­жен, в 1% случаев результаты оказывались положительными даже в заведомо абациллярных образцах мокроты . Даже при истинно положительном ре­зультате, составляющем 25%, ложноположительные ответы были отмечены в 1,6—4,7% культур. Аналогичные результаты при изучении перекрестной кон­таминации были получены в последующих исследованиях с использованием метода фингерпринтов ДНК, проведенных в обычных лабораториях стран с низкой распространенностью туберкулеза [2, 3].

В странах со значительной распространенностью туберкулеза специфич­ность результатов, полученных методом бактериоскопии, может быть выше, чем при методе посева. Это обстоятельство имеет большое значение для диа­гностики туберкулеза , поскольку КУМ, обнаруженные при прямой бакте­риоскопии мокроты, почти всегда являются микобактериями туберкулеза. Верность данного положения подтверждается и в регионах со значительным бременем ВИЧ-инфекции . В противоположность этому посевы (или иные альтернативные методы видовой идентификации) остаются необходимыми в странах с низкой распространенностью туберкулезной инфекции. Часто только с их помощью удается дифференцировать туберкулез от других мико-бактериальных заболеваний.

Кроме того, учреждения здравоохранения в странах с высокой распростра­ненностью туберкулеза нередко бывают недоступными из-за препятствий гео­графического, финансового и культурного порядка. В результате часто пациенты обращаются в медицинские учреждения с уже запущенными деструктивными формами туберкулеза. Количество микобактерий в мокроте определяется, преж­де всего, характером туберкулезного процесса. Так, каверны диаметром около 2 см и с дренирующим бронхом могут содержать около 100 млн туберкулезных микобактерий. В то же время некавернозные поражения такого же размера, но без признаков деструкции, содержат всего 100—1000 бактерий . Мокрота больных кавернозными формами туберкулеза легких, в которой обнаруживаются отторгнутые некротические частицы, содержит огромное количество микобакте-рий, которые почти всегда обнаруживаются методом прямой бактериоскопии мазков. В отличие от этого мокрота больных с нодулярными инкапсулирован­ными поражениями легких содержит весьма небольшое количество возбудите­лей, которые не удается обнаружить при бактериоскопии мазков. Данная зависи­мость была четко продемонстрирована в исследовании, проведенном Ким и соавт. (Kim et al.) . Они сравнивали величину изменений в легких по рентге­нографическим данным, частоту положительных результатов посевов мокроты и результаты бактериоскопии концентрированной мокроты (рис. 1).

На основании проведенного сопоставления они показали, что различия в чувствительности методов посева и бактериоскопии наиболее выражены при активном выявлении случаев туберкулеза. При массовых обследованиях в боль­шинстве случаев выявляются менее тяжелые и даже субклинические формы за­болевания, но небольшое число больных с деструктивными процессами и с боль­шим количеством микобактерий в мокроте. Это положение иллюстрируется

Результатами сравнения методов бактериоскопии и посева при обзорных иссле­дованиях и наблюдениями, проведенными Национальным институтом туберку­леза в Бангалоре, Индия. Метод микроскопии во время массовых обследований позволял выявить от 40 до 50% общего числа больных с положительными резуль­татами посева мокроты и около 85% общего числа больных, обратившихся за по­мощью по поводу симптомов легочной патологии. .

Техническая обеспеченность позволяет повысить диагностическую инфор­мативность метода бактериоскопии мазков также и при распространении ВИЧ-инфекции [9, 10]. (см. главу 16 «Чем отличается диагностика туберкуле­за у лиц, инфицированных ВИЧ, от постановки диагноза у лиц, не инфициро­ванных ВИЧ?»). Относительная чувствительность методов посева и микроско­пии иллюстрирована в приведенной ниже табл. 11 (из публикации Урбанчик (игЬагюгю) ). Высокая информативность метода бактериоскопии (более 80%) была также отмечена и другими авторами, работавшими в регионах со значительной распространенностью туберкулеза и ВИЧ-инфекции [5, 10].

Практические исследования показали, что сравнительная результативность методов бактериоскопии и посева может существенно варьироваться. Некото­рые из таких вариаций могут объясняться популяционными особенностями (высокая или незначительная распространенность туберкулезной инфекции, раннее или позднее выявление больных), а также техническими деталями (на­пример, применение люминесцентной микроскопии, методов обогащения мо­кроты). Однако многое зависит от различий в самом выполнении тестов.

Высокая чувствительность метода посева, тем не менее, не обеспечивает осо­бых преимуществ при обследовании пациентов, обратившихся за помощью по поводу имеющихся у них симптомов легочных заболеваний. В странах с высокой распространенностью туберкулеза (с наличием ВИЧ-инфекции или без нее) до­полнительное преимущество посева над прямой бактериоскопией не превышает 25% . В странах с низкой распространенностью туберкулеза это преимущест­во более значительно. Благодаря методу посева число больных с бактериологиче­ским подтверждением диагноза туберкулеза удваивается. Кроме того, дополни­тельным достоинством метода посева является возможность идентификации вида выделенных микобактерий, что невозможно при бактериоскопии.

Таким образом, с точки зрения бактериолога, можно выделить две главные категории больных. Одна из них — это наиболее опасные в эпидемиологичес­ком плане больные, выделяющие большое количество микобактерий, присут­ствующих почти в каждой порции мокроты и легко выявляющихся при бакте­риоскопии ее мазков. Другая, менее опасная, группа больных, выделяющих небольшое количество микобактерий, обнаруживаемых преимущественно ме­тодом посева. Больные последней группы могут выделять микобактерии толь­ко время от времени (см. главу 11 «Какова дополнительная эффективность повторных исследований мокроты методами бактериоскопии и посева?»). Оче­видно, что эти две категории больных будут значительно отличаться также по клиническим и эпидемиологическим показателям.

Содержание микобактерий в мокроте и клинический прогноз

Прогноз у больного туберкулезом легких, выделяющего небольшое количест­во микобактерий, обнаруживаемых только при посеве, обычно гораздо благо­приятнее, чем прогноз у больного, в мокроте которого микобактерии обнару­живаются методом бактериоскопии мазка. Анализ исходов лечения впервые выявленных больных был проведен в районе юга Индии, где проводились ре­гулярные эпидемиологические обследования населения [13, 14]. Излечение (отсутствие микобактерий в мокроте при исследовании методами бактерио­скопии и посева) после 18 мес наблюдения наступило у половины всех боль­ных, у которых при выявлении процесса микобактерии в мокроте обнаружи­вались только методом посева, но отсутствовали при исследовании мазков мокроты (2 образца). Спустя 3 года наблюдения излеченными признаны око­ло 2/з таких больных. В то же время смерть наступила у 1/з больных, у которых возбудители выявлялись методом бактериоскопии мазков мокроты. Таким об­разом, даже при тяжелых условиях жизни в бедном сельском районе и без хи­миотерапии прогноз более благоприятен у больных, в мокроте которых мико-бактерии удается обнаружить только при посеве.

Более низкая смертность больных с отрицательными результатами бакте­риоскопии мазков мокроты может объясняться тем, что они были выявлены на раннем этапе заболевания. Нельзя исключить, что в последующем процесс у них будет прогрессировать, и они начнут выделять большое количество мико-бактерий, которые станут обнаруживаться и в мазках мокроты. Чтобы предот­вратить подобную динамику, считалось важным выявлять больных на раннем этапе процесса, когда распространенность его минимальная, а из зоны пораже­ния выделяется малое количество микобактерий, обнаружить которые удается только методом посева. Предполагалось также, что симптомы заболевания у та­ких пациентов могут отсутствовать, а сам процесс удается выявить только при массовых рентгенологических обследованиях. Удивительно, что данная гипоте­за не выдержала испытания временем.

В бывшей Чехословакии было проведено тщательное и продолжительное обследование населения рентгенографическим и бактериологическим мето­дами (см. главу 14 «Как развивается туберкулез легких и как он может быть выявлен на раннем этапе?»). Почти 95% населения одного из округов бывшей Чехословакии каждые 2—3 года проходило флюорографию органов грудной клетки с целью активного выявления случаев туберкулеза [ 15]. При каждом из таких периодических исследований выявлялось некоторое число новых боль­ных с преимущественно ограниченными поражениями легких. Микобакте-рии туберкулеза в мокроте, собираемой в течение 3 последовательных дней, у таких больных если и обнаруживались, то исключительно методом посева. Немедленно начинавшееся лечение туберкулеза приводило к излечению та­ких пациентов. Согласно принятой гипотезе, подобная тактика позволяла предупредить развитие распространенных форм туберкулеза, сопровождаю­щегося массивным бактериовыделением. Соответственно ожидалось, что бу­дет снижаться частота бациллярного туберкулеза в целом. Однако активное выявление больных и их лечение дало весьма малый эффект, так как значи­тельное число новых случаев туберкулеза обнаруживалось в промежутках между массовыми обследования населения. Причем эти выявленные по об­ращаемости больные страдали распространенными формами туберкулеза, а микобактерии в мокроте у них обнаруживались методом бактериоскопии мазков.

Это и другие исследования показали, что развитие новых случаев туберкуле­за, сопровождающегося обильным бактериовыделением, совсем не обязатель­но проходит раннюю стадию, когда бактериовыделение с мокротой отсутствует (см. главу 14 «Как развивается туберкулез легких и как он может быть выявлен на раннем этапе?»). Прогноз туберкулеза у больных, у которых микобактерии туберкулеза определяются только методом посева, но отсутствуют в мазках мо­кроты, гораздо более благоприятный, чем это полагали ранее. В большинстве подобных случаев туберкулезные изменения излечиваются или остаются ста­бильными. Лишь в меньшинстве случаев процесс прогрессирует и микобакте-рии начинают обнаруживаться методом микроскопии. Соответственно, ис­пользование высокочувствительного метода посева мокроты способно лишь незначительно повлиять на эпидемиологическую ситуацию.

Содержание микобактерий в мокроте и контагиозность

Различия между двумя выделенными группами больных особенно важны с эпи­демиологической точки зрения. Больные с отрицательными результатами бакте­риоскопии мазков мокроты представляют значительно меньшую опасность рас­пространения инфекции, чем пациенты с положительными результатами этого исследования. Подобное различие не должно вызывать удивления, так как оче­видны значительные различия в массивности бактериовыделения у этих двух ка­тегорий больных. Риск контакта с источником инфекции с положительным ре­зультатом бактериоскопии мазка мокроты возрастает в связи с тем, что кашель у таких больных бывает более частым и сильным [ 16]. Риск заболевания у семей­ных контактов с больными, в мокроте которых возбудители обнаруживаются только методом посева, во много раз ниже, чем у родственников, контактирую­щих с больным с положительным результатом бактериоскопии мазков мокроты. Непосредственный контакт с больными вне дома служит дополнительным фак­тором риска заболевания по сравнению с внутрисемейным, или «базисным» риском. Естественно, что внутрисемейный контакт значительно опаснее, чем внедомашний, особенно при скученности и проживании в условиях трущоб. Однако и в подобных ситуациях опасность внутрисемейного заражения при контакте с больным с отрицательным результатом бактериоскопии мазков, но с положительными результатами посева мокроты не превышает 10—20% от той опасности, которая существует при контакте с больными с положительными результатами бактериоскопии мазков мокроты [17, 18] (см. главу 15 «Какова роль периодических массовых рентгенологических обследований населения в выяв­лении новых случаев туберкулеза?»). Данное положение было подтверждено при исследовании, проведенном с применением метода фингерпринтов ДНК мико-бактерий (Сан-Франциско, США, 1991—1996 гг.). Было обнаружено, что всего

17% всех случаев заражения развились при контакте с больными ТБ с отрица­тельными результатами бактериоскопии мазков, но с положительными результа­тами посевов мокроты .

Выявление больных, выделяющих малые количества микобактерий тубер­кулеза, представляется не первоочередной задачей программы борьбы с ту­беркулезом. Если идентификация таких случаев заболевания предусматрива­ется программой, то это не должно становиться главным пунктом в стратегии выявления и соответственно в приоритетах диагностики. Все имеющиеся в настоящее время данные убеждают в том, что более 90% всех источников распространения туберкулеза в странах с неблагоприятной эпидемиологичес­кой ситуацией удается обнаружить вполне доступным методом бактериоско­пии мазков мокроты.

Существуют и иные причины менее частого использования метода посева при диагностике туберкулеза. В странах со значительным его распространени­ем приходится сталкиваться с ограниченностью финансовых и технических возможностей. Посевы мокроты для выявления микобактерии требуют специ­альных питательных сред (яичные или агаровые среды, т. е. среды Левенштей-на — Йенсена и Миддлбрука соответственно) и оказываются в 5—10 раз дороже при расчете на один образец, чем исследование мазка мокроты. Приобрести не­обходимое для культуральных исследований оборудование и соответственно обучить персонал также значительно труднее и дороже. Даже в медицинских центрах, где имеются все возможности для посевов, их используют преимуще­ственно для подтверждения диагноза туберкулеза при уже начатом лечении. Это связано с тем, что положительные результаты посева можно получить не ранее чем через 3 нед после инокуляции, а клиницист узнает о них не ранее чем через месяц. Естественно, врач не может ожидать результаты посева и назна­чает лечение на основании рентгенологических данных, являющихся непре­менным компонентом диагностического алгоритма. Именно данные рентгено­графии автоматически приобретают более важное значение, чем результаты посева (см. главу 13 «Каковы относительные преимущества рентгенологичес­кого исследования органов грудной клетки и исследования мокроты (методами бактериоскопии мазков и посевом) в выявлении новых случаев заболевания среди амбулаторных больных с длительно существующими симптомами пора­жения органов грудной клетки?»). Использование современных жидких сред и более чувствительных индикаторных систем позволяет сократить продолжи­тельность культурального исследования до 1—2 нед. Однако подобные системы весьма дороги и требуют высокой квалификации работников. Кроме того, диа­гностика, основанная на стандартном алгоритме исследований, в целом пред­почтительнее, как в отношении сроков начала лечения, так и затрат, по сравне­нию с использованием указанных систем для проведения посевов.

Все приведенные выше обстоятельства показывают, что культуральный метод диагностики туберкулеза приобретает более важное значение в услови­ях снижения распространенности этого заболевания. Даже запоздалое полу­чение результатов посева приобретает решающее значение, когда начинают превалировать труднодиагностируемые случаи заболевания, не вызывающие у клинициста подозрения в отношении туберкулеза. Это случаи не столь тя­желых процессов, редко сопровождающихся выделением значительного ко­личества микобактерий, которые можно обнаружить в мазках мокроты. В по­добных ситуациях более частыми становятся заболевания, вызванные менее патогенными нетуберкулезными микобактериями, которые требуют диффе­ренциации от других видов КУМ. Наконец, снижение распространенности туберкулеза обычно сопровождает улучшение экономики, что делает более вероятным обеспечение современным оборудованием и оптимальное исполь­зование культурального метода исследования.

До тех пор пока туберкулез будет широко распространенным заболевани­ем, культуральный метод исследования останется второстепенным, а основная роль в его диагностике будет принадлежит бактериоскопии мазков и методам клинико-рентгенологического обследования больных. Посевы должны прово­диться при диагностике внелегочного туберкулеза, если имеется возможность получения диагностического материала (например, при туберкулезе перифе­рических лимфатических узлов). Проведение посевов особенно показано у ВИЧ-инфицированных пациентов, так как это позволяет существенно со­кратить число ошибок при диагностике и лечении патологии у них. Посевы также необходимы для определения спектра лекарственной чувствительности возбудителя и контроля за развитием устойчивости к противотуберкулезным препаратам.

Роль культурального исследования при классификации случаев туберкулеза

Культуральное исследование для выявления микобактерий имеет значение при подтверждении диагноза туберкулеза. Однако в условиях реализации противо­туберкулезных мероприятий бактериоскопия мазков мокроты играет более важную роль. Продолжительное обзорное исследование на юге Индии , Предусматривавшее дифференцированный анализ факторов выживания, учи­тывало также и результаты бактериологических исследований. Посевы и мик­роскопическое исследование мазков мокроты проводились у всех пациентов, у которых при массовом рентгенологическом скрининге был заподозрен актив­ный туберкулез легких. За этими же больными устанавливалось наблюдение для уточнения динамики процесса в отсутствие противотуберкулезной химио­терапии. Порогом для причисления больного к бактериовыделителям служило обнаружение в одном мазке мокроты трех и более КУМ. Отрицательные ре­зультаты посева на микобактерии туберкулеза получены всего у 10% больных с отрицательными результатами бактериоскопии мазков мокроты. В противо­положность этому отрицательные результаты посева имели место у двух из каж­дых трех больных, выявленных при рентгенографии. У них также не было об­наружено других признаков прогрессирования процесса. Последующие исследования Подтвердили надежность того факта, что результаты бакте­риоскопии мазков мокроты являются «полномочными представителями» мето­да посева при классификации случаев туберкулеза. Действительно, всего

в 3—6% случаев у больных с положительными результатами бактериоскопии мазков мокроты не был получен рост микобактерий на питательных средах. Многие из этих больных с ложноположительными результатами бактериоско­пии мазков уже получали противотуберкулезные препараты, а повторные осмо­тры мазков часто могли подтвердить, что в данных случаях обнаруживались уже нежизнеспособные КУМ.

Термины: мокрота с положительным результатом бактериоскопии и случай туберкулеза легких с отрицательным результатом бактериоскопии мазков мок­роты подразумевают ограниченную чувствительность метода бактериоскопии мокроты. В то же время они подчеркивают первостепенную важность случаев заболевания с положительным результатом бактериоскопии мазков мокроты при контроле за характером заболевания.

Культуральное исследование может быть более информативным при под­тверждении излечения, неэффективности лечения или рецидива процесса. Ряд исследований, например Ол-Моумэри (Al-Moamary) и соавт. , Доказали за­медленную конверсию данных бактериоскопии, когда отрицательные результа­ты исследования мазков отмечались уже после того, как абациллирование до­стигалось по методу посева (рис. 2).

Видимые, но нерастущие микобактерии продолжают обнаруживаться в маз­ках мокроты даже спустя 5 мес после начала лечения и более. Повторные курсы химиотерапии, по наблюдению Райде (Rieder) , потребовались только в 2 из 8 случаев, когда бактериовыделение, по данным бактериоскопии, сохранялось через 5 мес лечения. Посевы позволяют провести более точную оценку в подоб­ных случаях, но они утрачивают практическое значение в большинстве иных си­туаций, например, для целей программы. Неэффективностью химиотерапии считается бактериовыделение, установленное методом посева через 5 мес лече­ния и позже. Лабораторные погрешности становятся одной из причин положи­тельных ответов бактериоскопии при отрицательных результатах посева.

С другой стороны, без метода посева остались бы нераспознанными неко­торые случаи неэффективного лечения, особенно если бактериоскопия мазков проводилась некачественно. Такие случаи нередко трактуются как «ранние ре­цидивы». Классификация случаев заболевания, основанная на данных бакте­риоскопии, недостаточно надежна в случаях неэффективной терапии и реци­дивов. В сложных условиях при ограниченности возможностей и задержках в получении результатов посева диагностика излечения, рецидива и неэффек­тивности терапии основывается преимущественно на бактериоскопии мазков мокроты, а посевы производятся по мере возможности.