Каковы преимущества и недостатки люминесцентной микроскопии?

Метод люминесцентной микроскопии был впервые использован для выявле­ния кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в 1930-х годах. Вначале обору­дование для данного метода было очень янесовершенным. С этими микроско­пами было трудно работать, и использовать их можно было только в темном помещении. Поэтому метод люминесцентной микроскопии не получил широ­кого распространения. Однако с тех пор оборудование для люминесцентной микроскопии было значительно усовершенствовано, а сам метод получил вы­сокую оценку во многих хорошо оснащенных лабораториях.

Основное достоинство данного метода — возможность изучения препара­тов с помощью объективов с меньшим увеличением (х25). В результате суще­ственно увеличивается площадь поля зрения (по сравнению с полем зрения, видимым в объективе с иммерсией). В частности, при люминесцентной мик­роскопии площадь поля зрения составляет 0,34 мм2, а при использовании им­мерсионного объектива — всего лишь 0,02 мм2. В результате люминесцентная микроскопия позволяет одну и ту же площадь мазка исследовать значительно быстрее, чем при микроскопии мазка, окрашенного по Цилю — Нильсену. За один рабочий день лабораторный работник может качественно исследовать не более 30—40 мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену; в то же время с по­мощью люминесцентной микроскопии тот же сотрудник за один день сможет исследовать не менее 100 мазков [/—^].

Поскольку за одинаковый период времени с помощью метода люминесцент­ной микроскопии можно исследовать в 15 раз больше полей зрения, чем при из­учении мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, вероятность выявления КУМ с помощью первого метода будет значительно выше, особенно в тех случа­ях, когда в мазке имеется небольшое количество этих бактерий. Справедливость этого положения была подтверждена результатами сравнительного изучения большого числа мазков. Исследование показало, что при люминесцентной ми­кроскопии в течение 1 мин было получено больше истинно положительных ре­зультатов (и не больше ложноположительных результатов), чем при исследова­нии в течение 4 мин мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену. В качестве эталона при этих исследованиях использовали результаты культуральных иссле­дований .

Сравнительному изучению этих двух методов было посвящено большое ко­личество независимых исследований. Так, например, было проведено парал­

лельное изучение 175 образцов мокроты (David and others, 1975 — неопублико­ванные данные). Из каждого образца мокроты готовили два мазка, которые ис­следовали независимо с помощью обычной микроскопии и с помощью люми­несцентной микроскопии. Результаты фиксировали отдельно для каждой пары мазков, а затем полученные данные вносили в специальную корреляционную таблицу (табл. 8). Идентичные результаты располагаются в ней по диагонали. Если не принимать во внимание расхождения в сортировке положительных от­ветов, в 157 из 175 случаев ответы были одинаковыми, т. е. совпадение имело место в 90% случаев.

В ранее проведенном более масштабном исследовании обоими методами было изучено 1383 образца мокроты ; Из каждого образца готовили два маз­ка и одновременно проводили культуральное исследование. Мазки исследова­ли независимо, один — люминесцентной микроскопией, другой — с помощью обычной световой микроскопии (табл. 9). Основной целью исследования было определение чувствительности обоих методов микроскопии по сравнению с посевом. Следующая цель состояла в том, чтобы установить ложноположи-тельные результаты люминесцентной микроскопии и, если они имеют место, то насколько часто. Эта информация представляет большой интерес, так как ранее было высказано мнение, что в мокроте нередко могут содержаться части­цы, которые окрашиваются люминесцентной микроскопией и вследствие это­го могут быть ошибочно приняты за КУМ .

Для удобства сравнительного анализа материалы табл. 9 представлены в двух различных аспектах в табл. 10. Сравнение результатов бактериоскопии мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, и люминесцентной микроскопии с результатами культурального метода показало незначительное преимущество люминесцентной микроскопии. С помощью этого метода из 655 образцов мо­кроты, из которых были выделены возбудители туберкулеза, КУМ были обна­ружены в 441 (67,7%) случае, а с помощью световой микроскопии — в 433 (66,1%) случаях.

Что касается ложноположительных результатов, то следует отметить, что между двумя использованными методами практически не было различий. Куль­туры возбудителей туберкулеза не были выделены из 3,3% образцов (15 из 456), в которых КУМ были обнаружены с помощью люминесцентной микроскопии. При бактериоскопии мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, ложнополо-жительные результаты были получены в 14 (3,1%) случаях из 447. Другими сло­вами, 97% положительных результатов, полученных любым из микроскопичес­ких методов, были подтверждены при посеве. Таким образом, опасения, что люминесцентная микроскопия достаточно специфична, оказались безоснова­тельными . Эти исследования проводились обычными лабораторными со­трудниками в лаборатории, где имелся опыт применения люминесцентной микроскопии. Полученные результаты можно расценивать как типичные для

специалистов, имеющих стандартную подготовку. Последующие исследования подтвердили идентичность результатов обоих методов при их применении в по­левых условиях. Тем не менее следует избегать условий, способствующих попа­данию в препараты небольшого количества неорганических кислотоустойчивых объектов, которые можно ошибочно принять за незначительное количество КУМ. Относительно возможности ложноположительных результатов люминес­центной микроскопии следует помнить о поговорке: «Не все, что блестит, явля­ется КУМ».

Недостатком люминесцентной микроскопии являются относительно боль­шие расходы, связанные с приобретением специального микроскопа и его об­служиванием. Тем не менее в центральных и в других крупных лабораториях, где для выполнения повседневного объема работы требуется три лабораторных работника с тремя обычными микроскопами (исследование 100—150 мазков в день), будет целесообразнее и дешевле использовать один флюоресцентный микроскоп. Эти расчеты можно применить и там, где лабораторные работники имеют низкую зарплату, например в развивающихся странах . В странах, где зарплата лабораторных работников выше, применение люминесцентной мик­роскопии оказывается экономически более оправданным, так как позволяет существенно снизить расходы на оплату труда специалистов [7, 8].

Другой недостаток люминесцентной микроскопии — необходимость в ква­лифицированном техническом персонале, способном обслуживать относи­тельно сложную аппаратуру. Кроме того, люминесцентный микроскоп не такой «прочный», как обычный световой. Время от времени нужно заменять некото­рые его детали, в частности лампы, иногда приходится производить какой-то мелкий ремонт, что сопряжено с немалыми затратами и техническими трудно­стями. Этот прибор необходимо также обеспечить постоянным поступлением электроэнергии с минимальными колебаниями напряжения, что может быть затруднено в развивающихся странах. Следует специально отметить, что рефе-ренс-лаборатории, оборудованные люминесцентными микроскопами, должны также использовать световые микроскопы для контроля качества работы и для обучения сотрудников периферических лабораторий.